mikrobiologie und diagnostik


Das Spektrum der Erreger von ARI ist sehr weit. Die diagnostischen Bemühungen sollten deshalb mehrere Erreger simultan erfassen. Nur bei einer geplanten Intervention gegen einen bestimmten Erreger sind Einzelverfahren sinnvoll. Für systematische Untersuchungen sind sie aber unzureichend, denn Interaktionen mit anderen Erregern können nicht abgeschätzt werden. Deshalb haben wir uns für Multiplex-Ansätze entschieden. Als Ausgangsmaterial dient das Nasopharyngealsekret (NPS). Das NPS ist die geeignetste Probenart für den Nachweis von viralen Atemwegserregern. Es sollten nur Erreger in die Methode eingeschlossen werden, die die oberen Atemwege nicht kolonisieren bzw. dort persistieren. Deshalb bleiben auch hier die konventionellen Erreger eine nicht erfaßte Größe.

Prinzipiell kommen direkte und indirekte (serologische) Nachweisverfahren in Frage. Für die Akutdiagnostik ist aber immer ein Direktnachweis vorzuziehen. Die Serologie kann mittels IgM oder Titerbewegungen von IgG in gepaarten Serumproben einen Nachweis erbringen, ist aber im ersten Fall nicht immer spezifisch und im zweiten Fall zeitraubend, so daß die Antikörperbestimmung ihre Domäne v.a. in der Seroepidemiologie hat.

Zum direkten Erregernachweis kommen Immunfluoreszenz, Antigen-ELISA, Viruskultur und molekularbiologische Verfahren in Betracht. Die alleinige Durchführung einer direkten Immunfluoreszenz mit Hilfe von monoklonalen Antikörpern hat sich nur für RSV in einigen Zentren durchgesetzt. Ansonsten wird sie heutzutage nur in Synopsis mit dem Ergebnis der Viruskultur verwendet, oder zum frühen Nachweis einer Virusvermehrung in der Zellkultur.

Für die meisten Atemwegsviren gilt die Zellkultur als Goldstandard. Mehrere Zelllinien (A549, MDCK, PMK, HEL, Hep2, LLC-MK2 u.a.) kommen zur Anwendung; und falls sie parallel mit einer Probe beimpft werden, haben Zellkulturen aufgrund überlappender Suszeptibilität für verschiedene Viren den Vorteil eines „screening-Effektes“. Ein genereller Nachteil ist, daß zum Nachweis in Zellkulturen vermehrungsfähige Viren erforderlich sind. Dies bedingt einen besonderen Aufwand für Transportmedien und Logistik. Die Kultivierungszeit konnte in den letzten Jahren für viele Erreger deutlich reduziert werden. Ungeeignet für eine zeitnahe Diagnose ist die Zellkultur für Rhinoviren und vermutlich auch für das neu entdeckte humane Metapneumovirus (hMPV).


molekularbiologische verfahren

NASBA (nucleic acid sequence based amplification) ist eine isotherme Amplifikations-technik v.a. für RNA-Zielsequenzen. Die LCR (ligase chain reaction) kommt nur bei M. tuberculosis und C. trachomatis zur Anwendung. Am häufigsten wird die PCR (polymerase chain reaction) verwendet. Wird eine reverse Transkription von RNA vorweg durchgeführt, kann das Verfahren für RNA und DNA-Zielsequenzen verwendet werden. Schnelle Verfahren mit einer online-Detektion, wie sie z.B. mit dem Lightcycler, dem TaqMan oder dem i-Cycler durchgeführt werden können, erlauben einen Erregernachweis innerhalb weniger Stunden. Nachteil dieser Techniken ist, daß der simultane Nachweis einer größeren Anzahl von Erregern derzeit noch nicht möglich ist. Für limitierte Untersuchungen, bei denen es um die Geschwindigkeit geht, sind diese Verfahren zwar überlegen, aber Instrumentarium und Reagenzien bisher jedoch sehr teuer.

Für systematische Untersuchungen bezüglich eines größeren Erregerspektrums werden im Projekt PID-ARI.Net Multiplex-PCR-Ansätze favorisiert. Diese erlauben zu kostengünstigen Bedingungen in einem Ansatz derzeit bereits bis zu 19 Erreger zu erfassen (Entwicklung im Labor Kiel). Dem Problem des ARI-Eisberges, auch in Bezug auf die gewichtete Vielzahl an Erregern, tragen Multiplex-Ansätze am besten Rechnung.

Der generelle Vorteil bei diesen Verfahren ist, daß sie kein vermehrungsfähiges Virus, sondern nur Nukleinsäuren als Grundlage benötigen. Der entscheidende Nachteil aber ist, daß aufgrund der genetischen Variabilität (Antigendrift) bei allen Atemwegsviren, nicht nur bei Influenza-Viren, es zu sogenannten diagnostischen escape-Mutanten kommen kann. Mutationen in den Primerbindungsorten oder der Bindungsstelle der Detektionssonde sind meist die Ursache.

ELISAs kommen v.a. in Form des Antigen-ELISA und v.a. in Schnelltesten zur Anwendung. Mehrere Teste für RSV, Influenza A und B sind auf dem Markt. Ihre Sensitivität und Spezifität ist im Vergleich zu den molekularvirologischen Verfahren deutlich schlechter (Sensitivität ca. 40-60%, Spezifität 80% [Zambon 2002]), so daß diese Tests für eine Diagnostik außerhalb der jährlichen Epidemie untauglich sind. Befunde in der Übergangsphase zur Epidemie sollten in jedem Falle durch ein zweites, unabhängiges Verfahren überprüft werden, bis feststeht, daß die Epidemie tatsächlich begonnen hat. Ein akkurates Testverfahren ist insbesondere auch für Entscheidungen zu einer riskanten Therapie vonnöten.

literatur
Zambon, M. The use of molecular methods for diagnosis and surveillance of respiratory viruses. Abstract S308. Programm 12th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Mailand, 24.-27.04.2002, 49.




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